聚合酶链式反应是什么？关于聚合酶链式反应的科普介绍

创闻用户 2022-07-27 14:51:51

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）是一种相对简单的技术和遗传学和基因组学检测工具。它可以把甚至是微量的样本中把放大到可以直接分析的程度。另外，传统的方法是将DNA序列克隆到载体上，然后在活细胞中进行复制，但这种方法通常需要几天或几周的时间，而通过PCR扩增DNA序列只需要几个小时等，所以PCR可以在短的时间内实现更灵敏的检测和更高水平的特定序列扩增。这使PCR不仅在基础研究中，而且在商业应用，包括基因鉴定、法医鉴定、工业质量控制和体外诊断等领域都发挥着重要的作用。

背景

基本介绍

PCR最初被用来扩增较长DNA分子的某些片段(Saiki等，1985年)。典型的扩增反应包括靶DNA、热稳定性DNA聚合酶、两个寡核苷酸引物、脱氧核苷酸三磷酸盐(dNTPs)、反应缓冲液和MgCl2。反应液配好后装入PCR管中再放入在热循环器中开始扩增（热循环器是一种使反应在设定时间内经受一系列不同温度的仪器）。其中一个系列的温度和时间循环称为一个放大周期。理论上讲，每一个PCR周期会使反应中靶序列(扩增子)的数量增加一倍。十个周期理论上约放大一千倍；20个循环，会使靶序列在几小时内增加约一百万倍。由于PCR可以实现对目标序列的扩增，所以这也可以说是一种DNA纯化技术。

PCR与诺贝尔化学奖

PCR的发明者凯利·穆利斯（Kary.B.Mullis）于1993年与迈克尔·史密斯分享了诺贝尔化学奖。此外，凯利·穆利斯还有本自传《心灵裸舞》。

PCR原理

聚合酶链反应是在一个反应混合物中进行的，该反应混合物包括DNA提取(模板DNA)、Taq聚合酶、引物，以及在缓冲溶液中过量的四种脱氧核糖核酸苷三磷酸盐(dNTPs)。PCR的过程分为三个阶段：

变性 Denaturation

利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。

退火或称接合 Annealing

在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引子熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。

延伸 Extension

DNA聚合酶由降温时结合上的引子开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。

碱基互补配对

DNA复制的保真性依赖于碱基互补配对原则。即A（腺嘌呤）与另一条长链上的T（胸腺嘧啶）形成氢键; 而G（鸟嘌呤）总是与C（胞嘧啶）形成氢键，即A=T、G≡C。这也是保持核酸结构的稳定的两个重要因素之一（另一个是伦敦色散力和疏水作用。）

引物设计

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

1、引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2、避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6 lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3、长度

寡核苷酸引物长度为15~30 bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃)，不能保证产物的特异性。

4. G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5. 碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6. 引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7. 引物之间

两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8. 引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9. 引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10. 密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。

反应液配置示例

试剂

GoTaq® G2 DNA Polymerase and Reaction Buffer (Cat.# M7841)

PCR Nucleotide Mix (Cat.# C1141)

Nuclease-Free Water (Cat.# P1193)

upstream primer

downstream primer

template DNA

mineral oil (选用)

发展及前景

应用

PCR有许多应用。这是一种现在在细胞和分子生物学中必不可少的技术。它允许，特别是在几个小时内，通过自动化系统“非细胞克隆”DNA片段，这通常需要几天的标准技术的分子克隆。另一方面，PCR被广泛用于诊断目的，以检测特定的DNA序列的存在这个或那个生物体在生物液体。它还被用来制作遗传指纹，无论是在司法调查中对一个人的遗传鉴定，还是对动物品种、植物或微生物进行食品质量检测、诊断或品种选择的鉴定。PCR仍然是进行测序或定点突变所必需的。另外还有一些关于PCR技术改良的报道例如金属有机框架辅助的高效聚合酶链式反应。