线粒体内膜上。

丙酮酸脱氢酶是由三个酶组合的复合体，负责催化丙酮酸脱羧，生成乙酰辅酶A的不可逆反应，分布在线粒体内膜上。酶具有无活性（磷酶化）和有活性（去磷酸化）两种形式，这一点与磷酸化酶不同。有多种别构调节剂调控二种酶形式的转换，并受激素活动影响。